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实验方案 ▏下肢缺血（血管再生）
发布时间：2019-09-06 18:24 | 点击次数：
下肢缺血试验应用
血管新生是缺血性心血管疾病血流阻塞后改善血流灌注的重要机制。然而, 目前临床上尚缺乏一种简单、无创和特异的直接评价血管新生的方法。下肢缺血试验是进行血管新生评价的重要试验。使用大鼠或小鼠对其麻醉后予结扎一侧下肢股动脉制备下肢缺血模型, 另一侧下肢作为对照组。术后使用激光多普勒血流成像仪对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流量。然后每周对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流恢复状况。
下肢缺血试验是进行缺血性心血管病与治疗性血管新生研究的重要方法，可以将促血管新生因子注入体内，促进缺血局部血管新生与侧支循环，改善组织的血液供应与功能，进而评价促血管新生因子的作用。促血管新生因子可以是促血管新生药物、蛋白、基因和干细胞治疗。
除心脏血管疾病研究外，还可使用下肢缺血试验评价糖尿病、外周血管疾病、伤口愈合等方面的血管新生研究。
所需设备
血管新生是缺血性心血管疾病血流阻塞后改善血流灌注的重要机制。然而, 目前临床上尚缺乏一种简单、无创和特异的直接评价血管新生的方法。下肢缺血试验是进行血管新生评价的重要试验。使用大鼠或小鼠对其麻醉后予结扎一侧下肢股动脉制备下肢缺血模型, 另一侧下肢作为对照组。术后使用激光多普勒血流成像仪对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流量。然后每周对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流恢复状况。
下肢缺血试验是进行缺血性心血管病与治疗性血管新生研究的重要方法，可以将促血管新生因子注入体内，促进缺血局部血管新生与侧支循环，改善组织的血液供应与功能，进而评价促血管新生因子的作用。促血管新生因子可以是促血管新生药物、蛋白、基因和干细胞治疗。
除心脏血管疾病研究外，还可使用下肢缺血试验评价糖尿病、外周血管疾病、伤口愈合等方面的血管新生研究。
所需设备
手术方法
小鼠吸入麻醉（异氟烷）维持浓度 1-1.5%，置仰卧位，用橡皮筋将小鼠固定于手术板上。常规备皮，碘伏消毒，铺无菌洞巾。使用眼科镊轻轻提起皮肤，从腹股沟到大腿内 侧沿着血管走向用眼科剪剪开一纵形切口，长约 5 mm。 在 20 倍的解剖显微镜视野下使用尖镊轻轻的刺破 膜状血管鞘，暴露股动脉、股静脉及其分支（图 1）。使用 显微器械的弯镊和直镊分离、游离股动脉，防止损伤股 静脉和股神经，分别用 7 号手术缝线在股深动脉起始点 近端高位结扎并离断一段股动脉的方法制作高位结扎 并离断股动脉下肢缺血模型（图 2）、在股深动脉起始点 近端单纯性结扎股动脉的方法制作单纯性高位结扎股 动脉下肢缺血模型（图 3）和在股总动脉远端和股浅动脉 近端单纯性结扎股动脉的方法制作单纯性低位结扎股 动脉下肢缺血模型（图 4）。术后第 1~5 天进行连续的观察记录。
激光多普勒检测
小鼠麻醉成功后，俯卧位置于激光多普勒扫描头下方，使用双面胶固定其双后足使其足底面朝上且左右对称，使扫描区包含双后爪。
图 5 手术后当天，缺血侧肢体相对于正常侧缺血率可达 80-90%。
病理学观察
组织切片中可见手术侧下肢横纹肌呈不规则片状凝固性坏死，凝固性坏死区周围可见大小及多少不等的 梭形肌卫星细胞增生，这些细胞紧贴坏死肌纤维表面或 浸入坏死肌纤维中，最终增生的卫星细胞取代坏死肌纤维，呈团块和/或不规则弥散状分布，可见大量肌卫星细 胞分化形成肌管。肌管橫切面呈圆形，胞浆红染，单个或多个核位于中心，肌管周围有结缔组织和新生血管。
图 8 在使用促血管新生因子后，可观察到缺血侧肢体血流恢复过程。
Reference
Aicher A., Heeschen C., Sasaki K., Urbich C., Zeiher A. M., Dimmeler S. 2006
Low-energy shock wave for enhancing recruitment of endothelial progenitor cells: a new modality to increase efficacy of cell therapy in chronic hind limb ischemia.
Circulation, 114 (25), pp 2823-30
Chalothorn D, Zhang H, Clayton J. A, Thomas S. A, Faber J. E, 2005.
Catecholamines augment collateral vessel growth and angiogenesis in hindlimb ischemia.
American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology Published 1 August 2005 Vol. 289 no. 2, H947-H959.
Crawford R. S., Albadawi H., Atkins M. D., Jones J. E., Yoo H. J., Conrad M. F., Austen Jr W. G., Watkins M. T. 2010
Postischemic poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibition reduces ischemia reperfusion injury in a hind-limb ischemia model.
Surgery, 148 (1), pp 110 - 118
Tritsaris K., Myren M., Ditlev S. B., Hübschmann M. V., van der Blom I., Hansen A. J., Olsen U. B., Cao R. , Zhang J., Jia T., Wahlberg E., Dissing S., Cao Y. 2007
L-20 is an arteriogenic cytokine that remodels collateral networks and improves functions of ischemic hind limbs.
Proc Natl AcadSci U S A.104 (39), pp 15364-9
Turgeon J., Dussault S., Haddad P., Groleau J., Ménard C, Michaud S. E., Maingrette F., Rivard A. 2010
Probucol and antioxidant vitamins rescue ischemia-induced neovascularization ………. exposed to cigarette smoke: Potential role of endothelial progenitor cells.
Atherosclerosis 208, spp 342–349
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